Osmanlılar'ın büyük zaferi ile sonuçlanan ve Türkler'in Batı Akdeniz'den çıkarılamayacağını bir kere daha ortaya koyan Cerbe Muharebesi'nden sonra dikkatler Malta'ya çevrildi. Çünkü Mısır, Trablusgarp, Cezayir ve diğer bazı önemli yerlerin idare ve emniyeti Malta’nın Osmanlı idaresinde bulunmasını gerektiriyordu. Rodos Adası’nın Osmanlılar tarafından fethinden (l522) sonra buradan çıkarılan Saint Jean Şövalyeleri Şarlken tarafından Malta'ya yerleştirilmişti. Ada, kısa bir zaman içinde şövalyeler tarafından çok güçlü ve zararlı bir hale getirilmişti. Korsanlık faaliyetleriyle ticaret gemilerini vurmak suretiyle Osmanlı ticaretine zarar veriyor ve nihayet Osmanlılar'a karşı yapılan bütün savaşlara iştirak ediyorlardı. Ayrıca Hıristiyan korsan gemileri için de güvenli bir sığınak konumundaydılar. Bütün bu sebeplerden dolayı Osmanlı Devleti yönünü Malta'ya çevirdi. İspanyollar ise Malta’nın düşmesi durumunda bunun aleyhlerine büyük sonuçlar doğuracağını ve Osmanlı Donanması'nın Sicilya, Napoli ve çevresine kadar ulaşacağını bildiklerinden Malta’nın savunmasına büyük bir önem veriyorlardı.

Osmanlı yönetimi Malta Seferi konusunda acele etmemesine rağmen bir Türk gemisinin Zenta ve Kefalonya Adaları arasında 7 Malta korsan gemisi tarafından ele geçirilmesi üzerine "Ahali-i İslâm-i Nüsret encâma zarar ve haşaretten hâli olmayan" Malta'nın alınması için yönetimi harekete geçildi. Haliç, Gelibolu ve Sinop tersanelerinde yeni gemiler inşa ve mevcudular tamir edilip kalafatlanırken, bazı gönüllü reisler için Rodos'ta l8 oturaklı kaliteler yaptırılması yoluna da gidildi. Osmanlı Donanması, 29 Mart l565'te 300'e yakın irili ufaklı gemi ve 45.000 kişiden oluşan büyük bir ordu ile Malta'ya hareket ederek l9 Mayıs’ta adaya asker çıkardı. Ancak Turgut Reis, kuşatmanın birinci ayında Sant Elmo burçları önünde atılan bir top güllesinin çarptığı kayadan fırlayan bir taşın başına isabet etmesi sonucu şehit oldu.

Saint Helen Kalesi 17 günde (24 Haziran l565) fethedilmekle beraber asıl maksat olan Malta kuşatıldı. Son kale olan Malta bütün varlığıyla direnmekteydi. Çok şiddetle devam eden çarpışmalarda Osmanlı ordusu 20.000 şehit verdi. Kalenin hem sağlam bir mevkide bulunması hem de çok kuvvetli surlarla çevrili olmasının yanında adanın gereği gibi abluka altına alınamaması da dışardan sürekli takviye yardımların gelmesine sebep oluyordu. Kuşatmanın uzamasından dolayı donanmanın maruz kaldığı erzak ve malzeme sıkıntısı da adanın fethine imkan vermedi. Sicilya genel valisinin İspanya, Fransa ve Papalık desteğiyle 72 kadırga ve 10.000 askerle yardıma gelmesi ve deniz mevsiminin geçmekte olduğunun görülmesi üzerine kalenin alınamayacağı anlaşılarak kuşatmaya son verildi. Nihayet Serdar Mustafa Paşa 11 Eylül'de asker ve malzemeyi gemilere yükleterek dönmek üzere denize açıldı.