Kanuni Sultan Süleyman, Belgrad’ı fethettikten sonra Rodos’u da almaya karar verdi. Osmanlı'nın niyetini öğrenen Şövalyeler Kralı Vilye dö Lil Adam derhal harekete geçerek savaş hazırlıklarına başladı. 300 savaş ve 400 nakliye gemisinden meydana gelen donanmanın sevk ve idaresi ise Kurdoğlu Muslihiddin Reis’e verildi. 4 Haziran 1522’de, İstanbul’dan harekete geçen Osmanlı Donanması 24 Haziran’da Rodos’a ulaştı. Kanunî Sultan Süleyman ise, 16 Haziran’da kapıkulu ve eyalet askerleriyle birlikte, İstanbul’dan kara yoluyla harekete geçti. Kanunî, Kütahya yoluyla Marmaris’e, oradan da gemilerle Rodos’a çıktı (28 Temmuz). Teslim teklifinin şövalyeler tarafından reddi üzerine, Ağustosun birinci günü kale dövülmeye başlandı. Bütün Ağustos ayı, karşılıklı top ateşi ve yine karşılıklı lağım açmakla geçti. Açılan top ateşiyle, kalede mühim tahribat yapılmasına rağmen, bu tahribat kısa zamanda düşman tarafından kapatılıyordu. Türk lağımcılarının Rodos burçlarının altına açtıkları lağımlar sürekli düşman lağımlarıyla karşılaşıyor ve yer altında korkunç boğuşmalar oluyordu.

Bu sırada, 4 Eylül günü, İleki Adası'nın Kara Mahmud Reis tarafından zaptı haberi geldi. 6 Eylülde ise Rodos’un kuzeybatısında bulunan İncirli Adası ele geçirildi. 10 Aralığa kadar, şiddetli top atışları, lağımlar ve sık sık tekrarlanan umumî hücumlarla, kale iyice yıpratıldı. 18 Aralıkta yapılan bir büyük hücumda şövalyeler, şehir içindeki istihkam ve hendeklerin arkasına çekilmeye mecbur kaldılar ve daha fazla dayanamayarak teslim oldular. (20 Aralık 1522).

Teslim şartları arasında; şövalyelerin eşya ve top dışındaki silahlarını alıp, on gün içinde Rodos’tan ayrılmaları; bu günler zarfında şehirdeki istihkâmların 4.000 yeniçeri tarafından emniyete alınması ve asıl kuvvetlerin iki kilometre mesafede beklemesi yer alıyordu. Kalenin boşaltma işlemlerinden sonra şövalyeler, Üstâd-ı âzam gemilerine binip gittiler. Rodos Kalesiyle beraber Oniki Adanın tamamı ve şövalyelere ait olan Bodrum da Osmanlı Devletine bırakılmıştı. Osmanlı Devletine, 20.000’den fazla şehide mâl olan bu fetihten sonra, Kanunî Sultan Süleyman 29 Aralıkta şehre girip kaleyi gezdi. 2 Ocak Cuma günü ise, camiye çevrilen Saint Jean Kilisesinde Cuma namazını kıldı. Nâmına okunan hutbeyi dinledi. Aynı gün, adadan ayrılıp Marmaris’e geçti.

3 Ocak günü Aydın, Midilli, Karasi, Menteşe, Saruhan sancakbeylerine, Anadolu Beylerbeyi Kasım Paşanın nezaretinde Rodos’taki inşaat, imar ve iskân işleri bitinceye kadar adada kalmalarını emredip, İstanbul’a döndü. Rodos’a derhal Türk göçmenleri yerleştirilmeye başlandı. Ada bir sancak yapılıp, Cezâyir-i Bahr-i Sefîd eyaletine bağlandı. Sancakbeyi olarak Mehmed Bey tayin edildi. Bundan sonra birçok cami, imaret, mektep, medrese ve yol yapılıp ada imar edildi.