Çevrimdışı

Bu forumdaki linkleri ve resimleri görebilmek için en az 25 mesajınız olması gerekir.

AMAÇ ve KAPSAM

Tüm gıda numunelerinde B.cereus aranması amacını taşır.Bacillus cereus; aerobik, çubuk şeklinde, spor oluşturan, gram pozitif, toprak ve bitki yüzeyinde yaygın olarak bulunan bir bakteridir. İşlenmiş ve çiğ gıdalarda Bacillus cereus > 106 /g olduğunda zehirlenmeye neden olabilmektedir.

PRENSİP

MYP Agar besiyerinde lesitinaz aktivitesi nedeniyle koloni etrafında çökelme halkası oluşurken mannitol fermantasyonu sonucu koloniler pembe renkte görünür.

Alet ve Ekipmanlar

Otoklav
Sterilizatör ( 160+5 oC)
İnkübatörler (30+1oC)
Analitik teraziler
Su banyosu (80-100oC)
Stomacher
pH metre
Bunzen beki
Steril bıçak, pens,spatül, vb. malzemeler
Tüp karıştırıcı
Plastik steril petriler (15x90mm )
Otomatik pipet ve steril pipet ucu
Cam tüpler ve tüp sporlar
Erlen ,beher,mezür vb. standart laboratuvar cam malzemesi
Koloni sayacı
Mikrodalga

Kullanılan Besiyerleri

MAXİMUM RECOVERY DİLUENT :

Formül :

Pepton : 1,0 g

Sodium clorür : 8,5 g

Distile su : 1 litre

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir.

MANNİTOL-EGG YOLK-POLYMIXIN (MYP) AGAR

Formül :

Beef extract : 1 g

Peptone : 10 g

Mannitol : 10 g

Phenol red

(%1’lik solisyon %95’lik ethanol): 2,5 ml

NaCl : 10 g

Agar : 15 g

Distile su : 900 ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7,2+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir.

Polymyxin B solüsyon

%0,1 : 500,000 ünite polymixin B sülfat 50ml distile suda çözündürülür. Filitre ederek steril edilir. 4oC’de saklanır.Yada hazırı temin edilir.

Egg yolk Emulsiyon

Otoklavdan çıkartılan MYP besiyeri 50oC’ye kadar soğuduğunda hazır besiyeri etiketindeki kadar aseptik koşullarda Egg Yolk Emulsion ile Polymyxin B solüsyon ilave edilir. Karıştırılarak petrilere dökülür. Petrilere streç filmlere sarılarak buzdolabında saklanır.

Kullanılan Biyokimyasal Besiyerleri

(istenirse hazır biyokimyasal test kitleri kullanılabilir)

NİTRAT BROHT:

Formul:

Peptone : 5 g

Beef extract : 3 g

KNO3 : 1 g

Distile su : 1000 ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği 5 ml olarak 16X125 mm tüplere bölünür. 121oC’de15 dakika otoklav edilir.pH 7,0+0,2 olacak şekilde ayarlanır.

TYROSİNE AGAR:

Formul:

(NUTRİENT AGAR):

Peptone : 5 g

Beef extract : 3 g

Agar : 15 g

Distile su : 1000 ml

Tartlan hazır besiyeri eritilerek çözündürülür. 121oC’de15 dakika otoklav edilir.pH 6,8+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 48oC de bekletilir.

Tyrosine süspansiyon: 0,5 g L-tyrosine 10 ml distile su ile çözündürülür. 121oC’de15 dakika otoklav edilir.

100 ml olarak hazırlanan 48cC’deki nutrient agara yeni hazırladığımız tyrosine süspansiyon ilave edilirek karıştırlır. Aseptik koşullarda tüplere bölünür ve Tirozinin ayrılmasını önlemek için tüpler yana yatık olarak bekletilir.

NUTRİENT BROHT (içinde % 0.001 lizozim içeren):

Formul:

Peptone : 5 g

Beef extract : 3 g

Distile su : 1000 ml

Tartılan besiyeri eritilerek çözündürülür. 121oC’de15 dakika otoklav edilir.pH 6,8+0,2 olacak şekilde ayarlanır. Oda sıcaklığında bekletilir. (99 ml hazırlanır)

Lysozyme solisyon: 0,1g lysozyme, 65 ml distile su ile karıştırılır.100ml tamamlamak üzere 0,01 N HCl eklenir. 045 mikron genişlikte membran flitre ile sterilize edilir.

99ml nutrient broth besiyerine 1 ml lysozyme solüsyonu ilave edilir. Aseptik koşullarda 2,5ml olarak tüplere bölünür.

PHENOL RED GLUCOSE BROTH:

Proteose peptone: 10 g

NaCl: 5 g

Beef extract: 1 g

Dextrose: 5 g

Phenol red (7,2 ml %0,25’lik): 0,018g

Distile su: 1000 ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği 2,5 ml olarak tüplere bölünür. 118oC 10 dakika otoklav edilir.pH 7,4+0,2 olacak şekilde ayarlanır.

MR-VP BROTH

Formül :

Peptone: 5g

Glukose: 5g

Phosphate buffer: 5g

Distile su: 1 litre

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür.10 ml olarak tüplere bölünür.121oC’de 15 dakika otoklav edilir. Sonunda pH 7,5+0,2 olacak şekilde ayarlanır

VOGES-PROSKAUER (VP) AYIRACI

Formül :SOLÜSYON 1 (Bu çözelti saman sarısı renkte olmalıdır.)

α-naphtol : 5 g

absolute Alkol : 100 ml

Formül :SOLÜSYON 2

potasyum hidroxide: 40 g

distile su: 100 ml

UYGULAMA

25 g(ml) örnek 225 ml (yada x numune miktarı x9 dilisyon sıvısı) Maximum Recovery Diluent ile gıda mikrobiyolojisi laboratuvar kurallarına uygun olarak homojenize edilir.Bu 1/10’luk dilüsyondan 0,1ml alınarak önceden hazırlanmış olan TSC(Egg yolk’lu) besiyeri içeren petrilere yayma yöntemine göre yüzeye ekim yapılır. Eğer numunedeki B.cereus sayısı yüksek bekleniyorsa seri dilisyonlar da yapılabilir.Petriler 30 oC de 24 saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası çevresinde opak zon oluşan Lesitinaz pozitif ve pembe renkli koloniler sayılır. Reaksiyon net değilse, 24 saat daha inkübasyona bırakılır. Doğrulama testi için bu kolonilerden Nutrient agar üzerine ekim yapılır. 24 saat 30 oC de inkübe ederek tipik koloniler zenginleştirilir.Doğrulama tesstleri yapılır.Petrilerdeki koloni sayısı 25-250 arası olursa sayılabilir. Sonuç kob/g veya kob/ml olarak verilir.

Doğrulama Testi

Biyokimyasal Testler Sonuçlar
Nitrat redüksiyonu +
Tirosin reaksiyonu +
Lizozim reaksiyonu +
Anaerobik ortamda glukoz fermantasyonu +
VP testi +




aLinti..

__________________

#MustafaKemaLAtatürkTorunuyum..ღ ❦

{22~02~`22..∞}
{09~09~`22..ღ}